معلومة

أين يمكنني العثور على مستويات التعبير البروتيني الخاص بالأنسجة لـ hTERT (وحدة التيلوميراز الفرعية)؟

أين يمكنني العثور على مستويات التعبير البروتيني الخاص بالأنسجة لـ hTERT (وحدة التيلوميراز الفرعية)؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أجد عددًا من المصادر المتناقضة فيما يتعلق بالأنسجة التي يتم فيها التعبير عن البروتين hTERT. هل يعرف أي شخص بعض الموارد التي تسرد بشكل رسمي (موثوق بها أو مقبولة على نطاق واسع قدر الإمكان) الأنسجة المختلفة ومستويات التعبير البروتيني لـ hTERT؟

أي مورد مماثل للتعبير الجيني عن HTERT؟


لقد وجدت أن موقع biogps.org يحتوي على جميع بيانات التعبير التي أحتاجها:

https://biogps.org

https://biogps.org/#goto=genereport&id=7015


آليات النسخ العكسي للتيلوميراز البشري (hتيرت) التنظيم: التأثيرات السريرية في السرطان

التجديد الذاتي اللامحدود هو أحد السمات المميزة للسرطان ويتم تحقيقه من خلال صيانة التيلومير ، بشكل أساسي من خلال التيلوميراز (hتيرت) التنشيط. تنظيم النسخ من حتيرت يعتقد أنه يلعب دورًا رئيسيًا في تنشيط التيلوميراز في السرطانات البشرية.

الجسم الرئيسي

ينجم الاهتمام المهيمن عن الإنزيم تيلوميراز عن دوره في السرطان. إن دور التيلوميرات وآليات صيانة التيلومير راسخ كقوة دافعة رئيسية في توليد عدم الاستقرار الكروموسومي والجيني. اكتسبت الخلايا السرطانية القدرة على التغلب على مصيرها من الشيخوخة من خلال آليات الحفاظ على طول التيلومير ، وخاصة عن طريق تنشيط التيلوميراز.

حتيرت يتم تنظيم التعبير في الأورام عن طريق آليات وراثية وجينية متعددة بما في ذلك hتيرت التضخيم ، حتيرت المتغيرات الهيكلية ، حتيرت المروج والتعديلات فوق الجينية من خلال hتيرت مثيلة المروج. الوراثة (hتيرت المروج) و epigenetic (hتيرت أظهرت أحداث مثيلة المحفز و miRNAs) آثارًا سريرية في السرطانات التي تعتمد على hتيرت التنشيط. مع العلم أن التيلوميرات ضرورية للتجديد الذاتي الخلوي ، فإن الآليات المسؤولة عن صيانة التيلومير لها دور حاسم في أمراض السرطان وقد تكون مؤشرات حيوية للأورام. وهكذا ، بدلا من القياس الكمي تيرت التعبير وارتباطه بتنشيط التيلوميراز واكتشاف وتقييم الآليات المسؤولة عن تيرت يقدم التنظيم معلومات مهمة يمكن استخدامها للتشخيص والتشخيص ومراقبة العلاج في علم الأورام. علاوة على ذلك ، فإن الفهم الأفضل لهذه الآليات قد يعزز ترجمتها إلى علاجات فعالة للسرطان المستهدفة.

استنتاج

هنا ، قمنا بمراجعة الآليات الأساسية لـ hتيرت التنظيم ، ودورها في تكوين الأورام ، والتطبيقات السريرية المحتملة في السرطانات المعتمدة على التيلوميراز.


مقدمة

التيلوميرات هي تراكيب بروتينية DNA توجد في نهايات الكروموسومات الخطية. إنها تساعد في الحفاظ على الاستقرار الجيني من خلال تكوين هيكل غطاء خاص يحمي نهايات الكروموسوم من التدهور ، والاندماج من طرف إلى طرف ، والانتقالات (Bailey & Murnane ، 2006). تتكون التيلوميرات في الثدييات من الحمض النووي التيلومري (الحمض النووي أحادي الجديلة (ss) والمزدوج (ds)) ومجموعة متنوعة من البروتينات ، والتي يُطلق على جوهرها اسم مركب المأوى (Palm & de Lange ، 2008). في البشر ، يتكون الحمض النووي التيلومري من مجموعة ترادفية من تكرارات TTAGGG التي تتراوح من 10 إلى 15 كيلو بايت عند الولادة. في الخلايا الطبيعية ، تقصر التيلوميرات بعد كل جولة من انقسام الخلية لأن بوليميرات الحمض النووي التقليدية غير قادرة على تكرار نهايات الحمض النووي الخطي (Olovnikov، 1973 Harley وآخرون.، 1990). تعتبر التيلوميرات هي الساعة الجزيئية التي تحد من القدرة التكاثرية للخلايا لأن التيلوميرات القصيرة ثبت أنها تحفز الشيخوخة التكاثرية (Counter ، 1996). علاوة على ذلك ، ارتبط تقصير التيلومير بشيخوخة الكائن الحي والعديد من الأمراض البشرية المرتبطة بالعمر (Garcia وآخرون.، 2007). يمكن للآليات التي يمكن أن تحافظ على طول التيلومير وهيكل التيلومير الكلي أن تؤدي إلى تكاثر خلوي مطول وبالتالي إطالة العمر (Bodnar وآخرون.، 1998 Vaziri & Benchimol، 1998 Shay & Wright، 2007 Palm & de Lange، 2008).

الآلية التي بواسطتها تقوم معظم حقيقيات النوى بتجميع التيلوميرات الخاصة بها والحفاظ عليها هي من خلال إنزيم التيلوميراز ، وهو بروتين نووي بروتيني RT. يتكون التيلوميراز بالحد الأدنى من وحدة فرعية للبروتين التحفيزي ، ونسخة انعكاس الإنزيم تيلوميراز (TERT) ، وجزيء RNA ، وهو telomerase RNA (TR) (Greider & Blackburn ، 1985 ، 1989). لتجميع التكرارات التيلوميرية من جديد، عكس TERT ينسخ قالب RNA داخل TR إلى نهايات 3′ لـ ssDNA (Autexier & Lue ، 2006). تتمثل إحدى السمات الفريدة للإنزيم تيلوميراز في قدرته على تحفيز جولات متعددة من تخليق التيلومير دون الانفصال عن ركيزة الحمض النووي ، وهي خاصية تُعرف باسم عملية الإضافة المتكررة (RAP) (جريدر ، 1991).

ارتبطت العيوب في التنظيم أو التعبير عن أي مكون من مكونات التيلوميراز بمجموعة متنوعة من الأمراض البشرية. على سبيل المثال ، تم التعرف على انتفاخ التيلوميراز في العديد من السرطانات البشرية (Kim وآخرون.، 1994) ، بينما يرتبط انخفاض نشاط التيلوميراز وقصر التيلوميرات بالعديد من أمراض الشيخوخة المبكرة (Garcia وآخرون.، 2007). في الآونة الأخيرة ، الطفرات في HTERT و hTR تم تحديد الجينات في مجموعة فرعية من المرضى المصابين بالتليف الرئوي مجهول السبب (IPF) (Armanios وآخرون.، 2007 تساكيري وآخرون.، 2007). IPF هو مرض رئوي تدريجي وقاتل يتميز بالتليف وتلف حمة الرئة ، وخاصة في الظهارة السنخية (ديمبسي ، 2006). في حين أن سبب الإصابة غير معروف ، فإن مواقع التليف النشط تعكس إصلاحًا غير لائق للظهارة السنخية التالفة ويعتبر وجود بؤر ليفية وموت الخلايا المبرمج السنخي من السمات المميزة لـ IPF (ديمبسي ، 2006). IPF هو مرض الشيخوخة المبكرة الذي يظهر عادة بعد العقد الخامس من العمر ، مع زيادة انتشاره مع تقدم العمر. يبلغ متوسط ​​معدل الوفيات بسبب المرض ما يقرب من 3 سنوات بعد التشخيص الأولي ، ولا توجد حاليًا علاجات نهائية. تتمثل إحدى الصعوبات في تطوير الاستراتيجيات العلاجية لـ IPF في الآلية غير الواضحة المسؤولة عن مسببات المرض ، لذلك فإن الكشف عن الآليات الجزيئية وراء ظهور وتطور IPF أمر بالغ الأهمية لفهم هذا المرض.

في حين أن غالبية حالات IPF تعتبر متفرقة ، فإن ما يقرب من 15-20 ٪ من المرضى الذين يعانون من IPF لديهم تاريخ عائلي للمرض ، حيث يكون نمط الوراثة متسقًا مع الهيمنة الجسدية مع الاختراق المتغير (Marney وآخرون.، 2001). في عام 2007 ، تساكيري وآخرون. حددت عدة متغاير الزيجوت HTERT طفرات السلالة الجرثومية في مجموعات فرعية من المرضى الذين يعانون من IPF العائلي. كما قرروا أن شركات النقل HTERT أظهرت الطفرات تيلوميرات أقصر مقارنة بأفراد الأسرة المتطابقين مع العمر الذين لا يؤويون الطفرات. يشير هذا إلى أن نقص الإنزيم تيلوميراز الفرداني قد يؤدي إلى تسريع تقصير التيلومير وبالتالي المساهمة في تطوير IPF.

مع الآليات الجزيئية لـ IPF غير معروفة إلى حد كبير ، قمنا بالتحقيق في كيفية ارتباط IPF HTERT تؤثر الطفرات على وظيفة التيلوميراز. على وجه التحديد ، قمنا بتمييز تأثيرات ثلاث طفرات hTERT تم تحديدها مسبقًا والتي تتوافق مع بدائل الأحماض الأمينية V144M و R865C و R865H (Tsakiri وآخرون.، 2007) على وظيفة التيلوميراز. مع وجود بقايا V144 الموجودة في مجال TEN للنهاية N وبقايا R865 داخل الحافز C لمجال RT شديد الحفظ (الشكل 1 أ) ، افترضنا أن طفرات hTERT المرتبطة بـ IPF ستعطل وظيفة التيلوميراز. تم استخدام التقنيات الكيميائية الحيوية والخلوية لتحديد تأثير هذه الطفرات على RAP وربط الحمض النووي وتوليف الحمض النووي التيلومري ونمو الخلايا. لقد مكنتنا هذه الدراسات من تحديد hTERT V144 و R865 كمتبقيين يلعبان دورًا مهمًا في وظيفة التيلوميراز ، واستطالة التيلومير ، والخلود الخلوي.

في المختبر أنشطة التيلوميراز لثلاثة طفرات hTERT مرتبطة بـ IPF. (أ) التمثيل الخطي للوحدة الفرعية لبروتين hTERT في التيلوميراز ، حيث يتم حفظ كل من hTERT V144 و R865 جيدًا بين الأنواع المختلفة. (ب) تم عرض تفاعلات محللة الخلايا الشبكية للأرانب (RRL) التي تحتوي على hTERT wild-type (WT) أو V144M أو R865C أو R865H. في المختبر نشاط التيلوميراز باستخدام مقايسة بروتوكول تكرار التيلومير المتكرر (TRAP) في غياب (-) RNAse A. إضافة (+) من RNAse ألغى نشاط التيلوميراز. تمثل المثلثات خمسة أضعاف التخفيفات لكل تفاعل للتأكد من أن فحوصات التضخيم كانت في النطاق الخطي. كان RRL المحتوي على ناقل pCI الفارغ هو التحكم السلبي. نظرًا لأن TRAP عبارة عن اختبار قائم على PCR ، فلا يمكن استخدامه لتحديد إجمالي تخليق الحمض النووي أو تكرار عملية الإضافة ، لذلك تم إجراء اختبار تيلوميراز تقليدي أكثر تحديدًا (CTA) أيضًا. أظهر CTA أن hTERT V144M له مستويات نشاط مماثلة (ممثلة في تخليق الحمض النووي) مثل hTERT WT ، ومع ذلك ، أظهر hTERT R865C و R865H عيبًا شديدًا في تخليق الحمض النووي. (D) أظهر التعبير المشترك عن hTERT WT و hTERT V144M أو R865C أو R865H مستويات نشاط مماثلة مثل hTERT WT وحده. IPF ، التليف الرئوي مجهول السبب.


& ltp> يقدم هذا القسم أي معلومات مفيدة حول البروتين ، ومعظمها معلومات بيولوجية. & ltp> & lta href = '/ help / function_section' target = '_ top'> المزيد. & lt / a> & lt / p> الوظيفة i

التيلوميراز هو إنزيم بروتين نووي ضروري لتكرار نهاية الكروموسوم في معظم حقيقيات النوى. نشط في الخلايا السلفية والسرطانية. نشاط غير نشط أو منخفض جدًا في الخلايا الجسدية الطبيعية. المكون التحفيزي لمركب الإنزيم holoenzyme التيلروميراز الذي يتمثل نشاطه الرئيسي في استطالة التيلوميرات من خلال العمل كنسخة عكسية تضيف تكرارًا بسيطًا للتسلسل إلى نهايات الكروموسوم عن طريق نسخ تسلسل قالب داخل مكون RNA للإنزيم. يحفز الامتداد المعتمد على الحمض النووي الريبي (RNA) للطرف الصبغي 3'-chromosomal مع وحدة التكرار التيلوميرية 6-nucleotide ، 5'-TTAGGG-3 '. تتضمن الدورة التحفيزية ربط التمهيدي وتمديد التمهيدي وإطلاق المنتج بمجرد الوصول إلى حدود القالب أو انتقال المنتج الناشئ متبوعًا بمزيد من التمديد. أكثر نشاطًا على ركائز تحتوي على 2 أو 3 تكرارات تيلوميرية. يتم تنظيم نشاط التيلوميراز من خلال عدد من العوامل بما في ذلك البروتينات المرتبطة بمركب التيلوميراز والمرافقين ومعدلات عديد الببتيد. يعدل إشارات Wnt. يلعب أدوارًا مهمة في الشيخوخة ومضادات التبول.

& # xd & ltp> معلومات منظمة يدويًا والتي يوجد لها أدلة تجريبية منشورة. & lt / p> & # xd & # xd & ltp> & lta href = "/ manual / Evidences # ECO: 0000269"> المزيد. & lt / a> & lt / p> & # xd تأكيد يدوي استنادًا إلى التجربة في i


المواد والأساليب

زراعة الخلايا

تم الحصول على خطوط الخلايا C33A و SiHa و ME180 و HeLa المشتقة من سرطانات عنق الرحم ، بالإضافة إلى خطوط الخلايا TSU-PR1 و PC3 و DU145 المشتقة من سرطانات البروستاتا ، من مجموعة American Type Culture Collection. تم الحصول على خط خلايا سرطان الدم K562 من بنك إنقاذ أبحاث العلوم البشرية. نمت الخلايا السابقة في وسط إيجل المعدل من دولبيكو والأخيرة في RPMI 1640 ، وكلاهما تم تكميلهما بنسبة 10٪ من مصل العجل الجنيني ، في وجود 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.2. للحث على التمايز الخلوي ، تم تحضين خلايا K562 باستخدام phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) بتركيز نهائي قدره 80 نانومتر لمدة 48-72 ساعة.

البناء البلازميد

تم وصف تركيبات hTERT المروج - luciferase في دراسة سابقة (21). تم إنشاء هذه البلازميدات المراسل مع بلازميد مراسل لوسيفيراز المحسن / أقل من المحسن (بروميغا ، ماديسون ، ويسكونسن). يحتوي ناقل التعبير MZF-2 (pEF-BOS / MYC-MZF2) ، الذي تم توفيره من قِبل الدكتور S. متواليات في الطرف N- الطرفية البشرية MZF-2 [كدنا] (26). تم إجراء الطفرات الموجهة من الموقع المستندة إلى PCR لإنشاء مراسل متحولة pGL3-776-MZF2MT (27) حيث تم تغيير أربعة أشكال ربط إجماع لـ MZF-2 في كاتم الصوت المحتمل لمروج hTERT عن طريق طفرة الاستبدال.

فحص Luciferase

تم إجراء تعداء عابر لبلازميدات مراسل luciferase إلى خطوط الخلايا الملتصقة C33A و SiHa و HeLa و ME100 وخلايا K562 غير الملتصقة باستخدام LipofectAMINE (تقنيات الحياة ، Gaithersburg ، MD) و Tfx-20 (Promega) ، على التوالي ، وفقًا للبروتوكولات الموصى بها من قبل الشركات المصنعة. تم إجراء فحوصات Luciferase باستخدام نظام الفحص المزدوج Luciferase Reporter (Promega) ، حيث رينيلا تم نقل بلازميدات لوسيفيراز بشكل مشترك كبلازميدات تحكم لتوحيد كفاءة النسخ. أجريت جميع التجارب ثلاث مرات على الأقل مع كل بلازميد وكانت النتائج عبارة عن قيم متوسطة لنشاط اللوسيفيراز النسبي.

تمدد فحص PCR

للتحليلات الكمية لنشاط التيلوميراز ، تم إجراء فحوصات PCR الممتدة باستخدام نظام Telochaser وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (Toyobo ، طوكيو ، اليابان). تم فصل منتجات PCR بالكهرباء على هلام بولي أكريلاميد بنسبة 7 ٪ وتم تصورها باستخدام صبغة هلام الحمض النووي SYBR Green I (FMC BioProducts ، Rockland ، ME). لمراقبة كفاءة تضخيم PCR ، تمت إضافة 10 نانوغرام من الضوابط الداخلية من متواليات DNA phage (Toyobo) مع 50 pmol من البادئات المحددة (Toyobo) إلى خليط PCR لكل تفاعل. تم تحديد نشاط التيلوميراز النسبي عن طريق قياس شدة نطاق سلالم التيلوميراز ومقارنتها مع تلك الموجودة في الضوابط الداخلية. تم قياس شدة النطاق باستخدام برنامج تحليل صورة المعاهد الوطنية للصحة.

فحص RT – PCR

تم إجراء تحضير الحمض النووي الريبي الكلي من خطوط الخلايا بواسطة طريقة AGPC الموصوفة سابقًا (28). تم تصنيع أول حبلا (كدنا) مع النسخ العكسي AMV (فارماسيا) مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي الكلي من خطوط الخلايا. تم فحص cDNAs المُصنَّعة من كل عينة من RNA في 50 ميكرولتر من خليط التفاعل الذي يحتوي على 2 ملي مولار من تريس- حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 ، و 10 ملي مولار بوكل ، و 0.01 ملي مولار EDTA ، و 0.1 ملي مولار DTT ، و 5٪ جلسرين ، و 1 ملي مولار MgCl2، 0.05٪ توين -20 ، 0.05٪ نونيديت P-40 ، 5 يو طق بوليميريز الحمض النووي ، 200 ميكرومتر لكل dATP ، dCTP ، dTTP و dGTP ، 5 µCi [32 P] dCTP و 0.4 ميكرومتر من الاشعال ومضادات الحساسية. تم تسخين خليط التفاعل عند 90 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ثم تم إجراء 26 دورة من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، بما في ذلك التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، والتليين عند 65 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة. تم فصل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بالكهرباء على هلام بولي أكريلاميد بنسبة 8٪ وتم تحليل المواد الهلامية المجففة بواسطة التصوير الإشعاعي الذاتي. بالنسبة لتفاعلات PCR ، تم استخدام بادئات قليلة النوكليوتيد الحسية والمضادة للحساسية لـ MZF-2 (5′-CCGGAGATGGGT- CACAGTCC-3 ′ و 5′-TTGCTGAACCTTGCCAC-3). تم تقدير كفاءة تخليق (كدنا) من كل عينة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات الخاصة بـ GAPDH كما هو موضح سابقًا (27).

مقايسة التحول الجل

تم تحضير المستخلصات النووية من خلايا Cos7 و C33A كما هو موضح سابقًا (26). للإفراط في التعبير عن MZF-2 في خلايا Cos7 ، تم نقل 10 ميكروغرام من ناقل التعبير MZF-2 إلى 10 5 خلايا Cos7 بواسطة طريقة DEAE-dextran (28) في أطباق ثقافة 60 مم. بعد 48 ساعة تعداء ، تم حصاد الخلايا وتحضير المستخلصات النووية. كعنصر تحكم سلبي ، تم نقل النواقل الفارغة بنفس الطريقة. في اختبارات التحول الهلامي 5-10 ميكروغرام تم تحضين المستخلصات النووية بـ 0.5 ميكروغرام بولي (dI · dC) في وجود أو عدم وجود منافسين غير معنونين على الجليد لمدة 20 دقيقة في حجم تفاعل 25 ميكرولتر يحتوي على 10٪ جلسرين ، 25 ملي مولار HEPES ، pH 7.9 ، 50 ملي بوكل ، 0.5 ملي PMSF ، 1 ملي ديثيوثريتول و 4 مجم / مل من الألبومين المصل البقري. بعد الحضانة ، 10000 c.p.m من 32 تحقيقات قليلة النوكليوتيد المسمى P-end التي تحتوي على أشكال إجماع MZF-2 عند -687 (5′-GTTTGCTCATGGTGGGGACCCCTCGCCG-3 ′) أو أليغنوكليوتيدات متحولة (5′-GTTTGCTCATGGTAAAGACCCCTCGCCG تمت إضافتها ° وتم احتضان تفاعل 4-GTTGCTCATGTAAAGACCCCCG) C لمدة 20 دقيقة إضافية. بعد الرحلان الكهربائي على هلام بولي أكريلاميد 4٪ ، تم تجفيف الجل وتعريضه للتصوير الشعاعي الذاتي. بالنسبة للفحوصات الفائقة ، تم تحضين الجسم المضاد لعلامة حلقية مضادة لـ c-Myc (9E10 SantaCruz) مسبقًا باستخدام مستخلصات نووية لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية ، متبوعًا بتفاعل ارتباط.


ترتبط مستويات بروتين hTERT المنخفضة باختلال الصيغة الصبغية للحمض النووي في الغشاء المخاطي للقولون للمرضى الذين يعانون من التهاب القولون التقرحي طويل الأمد

حقوق النشر: & copy Friis-Ottessen et al. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب شروط ترخيص Creative Commons Attribution License [CC BY_NC 3.0].

هذا المقال مذكور في:

الملخص

مقدمة

التهاب القولون التقرحي (UC) هو مرض التهاب الأمعاء المرتبط بارتفاع خطر الإصابة بسرطان القولون والمستقيم ، وتشير التقديرات إلى أن 10٪ من المرضى الذين يعانون من التهاب القولون التقرحي لمدة 10 سنوات سيصابون بسرطان القولون والمستقيم (1،2). السبب المرضي الأساسي غير معروف تمامًا ، لكن الالتهاب المزمن يشوه مورفولوجيا الغشاء المخاطي ويؤدي إلى خلل التنسج وبالتالي الإصابة بالسرطان. تحدث الأورام السرطانية بشكل رئيسي بعد مرض طويل الأمد من 8-10 سنوات (3) ، وتتطور من خلال خلل التنسج منخفض وعالي الدرجة. تم الإبلاغ عن أن المرضى الذين يعانون من آفة واحدة فقط من خلل التنسج منخفض الدرجة قد يؤويون أيضًا سرطانات (4). قد يحتوي الغشاء المخاطي للقولون لمرضى جامعة كاليفورنيا أيضًا على تشوهات جزيئية شديدة ، مثل عدم استقرار الكروموسومات (5) واختلال الصيغة الصبغية للحمض النووي. قد يكون اختلال الصيغة الصبغية في الحمض النووي موجودًا في الغشاء المخاطي لخلل التنسج وغير خلل التنسج لمرضى جامعة كاليفورنيا ، ويقال إنه مرتبط بمدة المرض (6-9). يمكن وصفه بأنه عامل خطر مستقل لتطوير سرطان الغدة في جامعة كاليفورنيا (10،11). عادةً ما يُعتبر مرضى جامعة كاليفورنيا الذين يصابون بخلل التنسج أو الأورام الغدية متقدمين ، في حين أن المرضى الذين لا يطورون هذه الأنماط الظاهرية خلال عمر جامعة كاليفورنيا يعتبرون غير متقدمين. نظرًا لأنه يمكن اعتبار عدم توازن الصبغيات في الحمض النووي عامل خطر مستقل للأورام الخبيثة في الغشاء المخاطي للقولون في جامعة كاليفورنيا ، فقد قمنا أيضًا بتضمين ذلك كخاصية مميزة لحالة التقدم في جامعة كاليفورنيا. إن الآليات الكامنة وراء ما يجعل القولون UC مطورًا أو غير متطور ليست معروفة تمامًا ، ولذلك فمن المهم فحص الاختلافات في السمات الجزيئية للغشاء المخاطي بين هذين النوعين من القولون المتأثر بـ UC. يمكن أن تكون الخصائص الجزيئية لآفات خلل التنسج وكذلك غير خلل التنسج داخل مرضى التطور غير الموجودة في غير مرضى التطور ، مساهمة في فهم الآليات الكامنة وراء التسرطن في القولون UC ، والتي يمكن أن تكون بمثابة علامة للأفراد المعرضين للخطر.

التيلوميراز هو بروتين نووي ريبوني قادر على تمديد تسلسل التيلومير ، المعروف عمومًا بأنه نشط في خلايا الخط الجرثومي وغير نشط في معظم الخلايا الجسدية. الوحدتان الفرعيتان الرئيسيتان للإنزيم تيلوميراز هما الوحدة التحفيزية TERT-telomerase reverse transcriptase (hTERT في البشر) ، و TR (TER) ، مكون الحمض النووي الريبي (hTR أو hTER في البشر). بالإضافة إلى hTERT و hTR ، ترتبط أيضًا مجموعة من البروتينات الملحقة ارتباطًا وثيقًا بالمركب (12). يُفترض عمومًا أن يكون مستوى hTERT عاملاً مقيدًا لتجميع مركب التيلوميراز ، ويُذكر أن hTERT قد يلعب أيضًا دورًا في تكاثر الخلايا ، بعيدًا عن دوره في استطالة التيلومير (13). يتم الإبلاغ عن نشاط التيلوميراز بشكل متكرر في الخلايا السرطانية ، و

80-90٪ من جميع الأورام الصلبة ، بما في ذلك سرطان القولون والمستقيم ، أبلغت عن نشاط التيلوميراز (14-16). يُمكِّن التيلوميراز الخلايا السرطانية من تحقيق الخلود التكاثري ، وهو أحد السمات المميزة للسرطان (17). وبالتالي ، قد يؤدي نشاط التيلوميراز إلى زيادة عمر الخلية ، مما يؤدي إلى تراكم التغيرات الجينية في الخلية والتي قد تساهم مرة أخرى في تطور السرطان (18). في الغشاء المخاطي لجامعة كاليفورنيا ، تختلف التقارير عن نشاط التيلوميراز من المستويات المنخفضة (19) ، المستويات التي لا تختلف من القولون غير المتحدرة (20-22) ، لتقارير النشاط المرتفع (23 ، 24). استخدمت كل هذه التحقيقات إصدارات من اختبار بروتوكول التكرار التيلومري (TRAP) أو PCR-ELISA ، وهي طرق صالحة لقياس نشاط التيلوميراز في عينة باستخدام مستخلصات الأنسجة. نظرًا للمستويات العالية من الالتهاب في القولون في جامعة كاليفورنيا ، توجد مستويات مرتفعة من البلاعم والعدلات ، وبالتالي قد تشتمل مستخلصات الأنسجة من الغشاء المخاطي للقولون لمرضى جامعة كاليفورنيا على هذه الأنواع من الخلايا. وبالتالي ، فإن اختبار TRAP من الخلايا المخاطية في القولون قد لا يفرق بين نشاط التيلوميراز في الخلايا الضامة والخلايا البيضاء في الأنسجة من الخلايا الظهارية ، مما يجعل من الصعب تفسير النتائج. والجدير بالذكر ، في دراسة عن نشاط التيلوميراز في الغشاء المخاطي للقولون في جامعة كاليفورنيا ، حيث تم فصل الخلايا المخاطية عن الخلايا اللحمية ، أظهرت النتائج مستويات مختلفة من النشاط في المجموعتين. تم الإبلاغ عن مستويات نشاط التيلوميراز منخفضة في الغشاء المخاطي لخلل التنسج ، وتم الكشف عن ارتباط بين نشاط التيلوميراز والالتهاب. في هذا التقرير ، لم يتم تضمين حالة الحمض النووي (22). كما تم التكهن بما إذا كانت المستويات المرتفعة من نشاط التيلوميراز في الغشاء المخاطي لجامعة كاليفورنيا هي نتيجة مباشرة لتكاثر الخلايا المعزز في أنسجة القولون الملتهبة بنشاط (24).

في هذه الدراسة ، استخدمنا الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) لتقييم مستويات hTERT في مادة UC لأنها توفر ميزة تقييم تعبير البروتين في أنواع خلايا معينة داخل الأنسجة التي تم فحصها ، مما يسمح باستبعاد البلاعم والعدلات التي من شأنها تشويش hTERT بيانات المستوى. قمنا بتقييم مستويات البروتين hTERT باستخدام IHC في الخلايا المخاطية للقولون لمجموعة من مرضى التطور والتطور غير المتقدم للمرضى الذين يعانون من UC طويل الأمد ، للتحقق مما إذا كانت أي اختلافات في تعبير hTERT مرتبطة بحالة التطور أو تطور خلل التنسج المخاطي أو بالحمض النووي. وضع بلاوي.

المواد والأساليب

مرضى

تم تضمين ثلاثين مريضا يعانون من UC منذ فترة طويلة في هذا التقرير. عانى جميع المرضى من UC لمدة 10 سنوات قبل استئصال القولون ، وقد عانى بعض المرضى لمدة تصل إلى 30 عامًا. اختلف المرضى أيضًا بشكل كبير في العمر في الوقت الذي ظهرت فيه الأعراض لأول مرة (من 10 إلى 60 عامًا). كان من بين المرضى العشرة غير المتقدمين 5 ذكور و 5 إناث. وشمل المتقدمون 17 رجلاً و 3 إناث. تلقى استخدام هذه المواد لأغراض البحث الموافقة الأخلاقية من لجنة الأخلاقيات الإقليمية ، REK S-06062.

استئصال القولون في جامعة كاليفورنيا: مرضى التطور وغير مرضى التطور

تم وصف عينات استئصال القولون سابقًا بواسطة Burum-Auensen et al (25). تم تجميع استئصال القولون (ن = 30) في مرضى التطور وغير المتقدمين ، وكشفوا عن 10 غير مرضى لم تظهر عليهم آفات خلل التنسج ، و 20 من مرضى التطور الذين قدموا جميعًا منطقة واحدة على الأقل من خلل التنسج / السرطان. قدمت غالبية الحالات أيضًا اختلال الصيغة الصبغية للحمض النووي.

تم فحص ثمانية مواقع على الأقل من كل عملية استئصال للقولون ، وضمن مرضى التطور ، تم تحديد 83 منطقة غير خلل التنسج ، و 31 منطقة غير محددة لخلل التنسج ، و 29 منطقة بها خلل التنسج و 8 أورام غدية. نظرًا لأن تحليلاتنا ركزت على تغييرات التشكل السرطانية ، تم استبعاد الأورام الغدية. كشف ما مجموعه 18 منطقة غير خلل التنسج و 7 مناطق خلل التنسج عن عدم توازن الصبغيات في الحمض النووي. آفات التطور موضحة في الجدول 1. وبحسب التعريف ، كانت الآفات غير المتطورة ثنائية الصبغة وغير خلل التنسج.

الجدول الأول

ملخص الآفات في القولون المتقدم (ن = 20) وفقًا للتشكل وحالة الحمض النووي.

الجدول الأول

ملخص الآفات في القولون المتقدم (ن = 20) وفقًا للتشكل وحالة الحمض النووي.

عينة القولون #
30 70 71 99 132 159 164 169 174 176 177 191 192 199 205 225 1514 1701 1729 1789
مضاعف عدم التنسج 5 5 2 1 1 3 1 2 7 2 3 5 4 3 6 5 6 3 0 1
خلل التنسج إلى أجل غير مسمى 0 0 0 0 2 1 2 1 0 2 1 0 1 5 2 1 1 2 2 0
النمو الشاذ 0 2 0 3 1 1 2 0 1 0 0 0 1 0 1 2 0 2 6 0
غدية 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0
اختلال الصيغة الصبغية عدم التنسج 1 0 0 0 0 3 1 1 1 4 2 2 0 0 0 0 1 1 0 1
خلل التنسج إلى أجل غير مسمى 0 0 0 0 2 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 3
النمو الشاذ 0 0 0 1 1 1 2 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0
غدية 1 0 1 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

تمت إزالة الأورام الغدية من التحليلات.

HTERT IHC

تم إجراء المصفوفات الدقيقة للأنسجة (TMAs) من ثمانية مواقع داخل كل القولون باستخدام مصففة نسيج دقيقة من Beecher كما هو موضح سابقًا (25). كان الحجم الأساسي 0.6 ملم. تم تقييم جميع النوى مسبقًا من قبل أخصائي علم الأمراض ذي الخبرة (OPFC). تم أخذ عينات من نوى نسيجية على الأقل من كل منطقة مخاطية. تم استخدام قسمين من اللوزتين كعناصر تحكم إيجابية. تم تعريض المقاطع (4 ميكرومتر) لمحلول 0.5٪ H 2 O 2 لمدة 10 دقائق ، متبوعًا باسترجاع المستضد في محلول السترات عند درجة الحموضة 6.0. تم إجراء احتضان TMAs مع الجسم المضاد الأساسي ضد التيلوميراز [أحادي النسيلة للفأر ab5181 ، التخفيف (1: 500) Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة] ، لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم إجراء التلوين باستخدام آلة Ventana Nexes باستخدام مجموعة الكشف Ventana Iview DAB (Ventana Medical Systems ، Tucson ، AZ ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. المقاطع الملطخة بمحلول ملحي Tris-buffered (TBS) بدلاً من الأجسام المضادة الأولية كانت بمثابة عناصر تحكم سلبية في التلوين. تم تعريف تعبير البروتين hTERT لكل عينة كنسبة مئوية من الخلايا الإيجابية من أصل 1200 خلية ظهارية مخاطية تم اختيارها عشوائيًا. تم حساب الخلايا التي تحتوي على تلطيخ نووي فقط على أنها إيجابية للتعبير عن hTERT. يعرض الشكل 1. تلطيخ hTERT لعينة تحكم غير تابعة لجامعة كاليفورنيا وآفات التطور مع مستويات hTERT العالية والمنخفضة. 2).

شكل 1

الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) لـ HTERT. (أ) عينة تحكم غير تابعة لجامعة كاليفورنيا (من القسم الكامل) ، (ب) التهاب القولون التقرحي (UC) مع مستويات منخفضة من hTERT و (ج) آفة UC مع مستويات عالية من hTERT. صور القولون بجامعة كاليفورنيا مأخوذة من ميكروأري الأنسجة (TMA) -cores. تشير الأسهم إلى الخلايا المخاطية القولونية الموجبة لـ hTERT في مستويات التعبير المنخفضة ، وتمييز رؤوس الأسهم خلايا الدم البيضاء الملطخة بـ hTERT. الصور هي تكبير 400 ×.

الشكل 2

يؤكد تحليل اللطخة الغربية على خصوصية ab5181 ، وهو جسم مضاد أحادي النسيلة للتعبير عن hTERT. كان الجسم المضاد محددًا ، حيث أظهر نطاقًا واحدًا عند 127 كيلو دالتون عند اختباره باستخدام العديد من خطوط الخلايا السرطانية.

لقد قدمنا ​​سابقًا التلميع المناعي لـ Ki67 لهذه المادة ، حيث أظهر مستويات مرتفعة بشكل ملحوظ من Ki67 في كولونات UC مقارنةً بعناصر التحكم غير التابعة لجامعة كاليفورنيا (25).

تحليل احصائي

نظرًا لأن كل مريض مشمول في هذه الدراسة ساهم بأكثر من خزعة واحدة ، قمنا بتقييم مستويات تعبير البروتين فيما يتعلق بالمعلمات المورفولوجية ، بالإضافة إلى تحليلات الارتباط لمستويات البروتين لـ hTERT و Ki67 ، باستخدام نموذج متعدد المستويات يعوض عن اختلافات المريض. تم إجراء النموذج الخطي المختلط (LMM) ، مع تقديرات احتمالية قصوى مقيدة (REML) واختبار Bonferroni اللاحق. تم إجراء الاختبارات في 18 إحصائيات PASW ® (شيكاغو ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية). كانت جميع الاختبارات ثنائية الجانب والمستوى p 0.05 يدل على الأهمية.

نتائج

تقييم التحليل الحراري الميكانيكي (TMA)

لا تعرض TMAs باستمرار خبايا القولون الكاملة كما لوحظ في أقسام كاملة ، ولكن بما أننا وجدنا تعبير hTERT في دراستنا موزعًا بالتساوي في جميع أنحاء الغشاء المخاطي للقولون ، خلصنا إلى أنه يمكن تقدير مستويات بروتين hTERT بشكل موثوق (البيانات غير معروضة).

نظرًا لأن تعبير البروتين Ki67 مرتبط بجزء النمو في الغشاء المخاطي لجامعة كاليفورنيا في القولون ، فإننا لم نعتبر أن TMAs موثوقة في تقييم تعبير Ki67 المتعلق بتطور خلل التنسج.

تم إجراء تقييم تعبير البروتين Ki67 داخل نفس نوى الأنسجة كما هو الحال في تقييمات البروتين hTERT ، وبالتالي تم اعتبار تقييم الارتباط بين hTERT و Ki67 موثوقًا به.

مستويات hTERT في الغشاء المخاطي للقولون في مرضى التطور مقابل غير مرضى التطور

كانت مستويات hTERT مرتفعة بشكل ملحوظ (p & lt0.001) في الغشاء المخاطي للقولون للطور وغير مرضى التطور ، مقارنةً بعناصر التحكم غير التابعة لجامعة كاليفورنيا (الشكل 3). لم يلاحظ أي فرق في مقارنة استئصال القولون المتقدم وغير المتقدم. تم تقديم مستويات مرتفعة إحصائيًا من Ki67 في القولون UC العام مقارنةً بعناصر التحكم غير التابعة لـ UC سابقًا (25).

الشكل 3

hTERT في مرضى التهاب القولون التقرحي (UC) ، وغير المتقدمين وغير المتقدمين. تم الكشف عن مستويات بروتين hTERT بواسطة الكيمياء المناعية (IHC) في مرضى التطور ، وغير المتقدمين وغير المتطورين.

مستويات hTERT داخل الغشاء المخاطي للقولون في استئصال القولون المتقدم

تم تقسيم مرضى التطور وفقًا للعمر في البداية ، حيث تبين مؤخرًا أن مرضى التطور الذين يعانون من تأخر ظهور UC (& gt 50 عامًا) يختلفون في بيولوجيا التيلومير عن مرضى التطور مع بداية مبكرة لـ UC (& lt50 سنة) (26). لم تسفر النتائج عن أي فرق إحصائي في مستويات البروتين لـ hTERT عند مقارنة UC المتأخر والبداية المبكرة (p = 0.2).

لم يتم الكشف عن فروق ذات دلالة إحصائية في مستويات تعبير hTERT بين الآفات ثنائية الصبغيات والآفات التي تظهر اختلال الصيغة الصبغية ، دون تصحيح الفروق في مورفولوجيا الغشاء المخاطي (p = 0.12). لم يتم تحديد فروق ذات دلالة إحصائية في مستويات hTERT بين الآفات غير خلل التنسج والآفات غير محددة لخلل التنسج وآفات خلل التنسج دون تصحيح لحالة الحمض النووي (p = 0.14). ومع ذلك ، عند التقسيم الطبقي لتشكل الغشاء المخاطي ومقارنة مستويات بروتين hTERT داخل الآفات ثنائية الصبغيات مع تلك التي تؤوي مجموعات مختلة الصبغيات ، وجدنا أن آفات اختلال الصيغة الصبغية تميل إلى أن يكون لها تعبير hTERT أقل من نظيراتها ثنائية الصبغيات (الشكل 4).

الشكل 4

hTERT في الآفات ثنائية الصبغية واختلال الصيغة الصبغية من مرضى التطور. التعبير عن hTERT في غير مرضى التطور وداخل المناطق ذات الأشكال المختلفة التي تؤوي مجموعات ثنائية الصبغيات أو اختلال الصيغة الصبغية في مرضى التطور.

داخل آفات اختلال الصيغة الصبغية غير الصبغية والثنائية الصبغية للقولون المتقدم ، اختلفت مستويات hTERT إلى حد معتد به إحصائيًا (P = 0.037) عند استخدام LMM لحساب الفروق بين المرضى. يتم عرض القيم p المكتشفة باستخدام LMM لحالة DNA-ploidy داخل كل مجموعة مورفولوجية في الجدول II. من خلال تجاهل اختلافات المريض ، واستخدام اختبار t ، تم العثور على فرق معتد به إحصائيًا بين مستويات hTERT الطبقية لحالة DNA-ploidy داخل الآفات المسجلة على أنها غير محددة لخلل التنسج. الآفات ثنائية الصبغة لديها مستويات أعلى من hTERT من الآفات غير الصبغية.

الجدول الثاني

قيم p اختبار LMM لمستويات بروتين hTERT مقسمة لحالة DNA-ploidy داخل مراحل مورفولوجية مختلفة من مرضى التطور.

الجدول الثاني

قيم p اختبار LMM لمستويات بروتين hTERT مقسمة لحالة DNA-ploidy داخل مراحل مورفولوجية مختلفة من مرضى التطور.

علم التشكل المورفولوجيا ف القيمة
عدم التنسج 0.037
لأجل غير مسمى لخلل التنسج 0.374
النمو الشاذ 0.565

الارتباط بين مستويات البروتين من hTERT و Ki67 في الغشاء المخاطي للقولون لمقدمي التطور وغير مرضى التطور

كشف تحليل الارتباط بين hTERT و Ki67 عن نتائج ذات دلالة إحصائية داخل غير مرضى التطور (p = 0.047) عند استخدام LMM ، لتعويض اختلاف المريض. لم يتم الكشف عن أي ارتباط داخل الآفات المختلفة لمرض التطور (الجدول الثالث). لم يتم الكشف عن أي ارتباط بين مستويات البروتين لـ hTERT و Ki67 داخل مرضى التطور عند التقسيم الطبقي لحالة الحمض النووي.

الجدول الثالث

قيم P التي تم إنشاؤها من تحليلات LMM للارتباط بين تعبير البروتين hTERT و Ki67 في مورفولوجيا جامعة كاليفورنيا.

الجدول الثالث

قيم P التي تم إنشاؤها من تحليلات LMM للارتباط بين تعبير البروتين hTERT و Ki67 في مورفولوجيا جامعة كاليفورنيا.

علم التشكل المورفولوجيا ف القيمة
غير مطور 0.047
عدم التنسج 0.097
لأجل غير مسمى لخلل التنسج 0.102
النمو الشاذ 0.731

[i] LMM ، نموذج UC الخطي المختلط ، التهاب القولون التقرحي.

تم إجراء جميع التحليلات أيضًا باستثناء جميع الحالات التي تحتوي على أورام غدية. هذا لم يغير النتائج إلى أي درجة ذات دلالة إحصائية.

مناقشة

في هذه الدراسة ، وجدنا مستويات مرتفعة بشكل ملحوظ من بروتين hTERT في الغشاء المخاطي لكل من خلايا القولون UC المتقدمة وغير المتقدمة مقارنةً بعينات التحكم غير التابعة لـ UC (p & lt0.001) ، ولكن لم يتم اكتشاف فرق كبير بين مستويات hTERT في مرضى التطور. واستئصال القولون غير المتقدم. يقال إن UC هو مرض الشيخوخة المتسارعة للغشاء المخاطي للقولون (27) ، مع ارتفاع معدل انقسام الخلايا كما هو موثق بواسطة Greco et al (28). حقيقة أننا اكتشفنا مستويات hTERT مماثلة في استئصال القولون المتقدم وغير المتقدم يتوافق مع تلك الدراسات ، حيث عانى المرضى من UC لمدة 10 سنوات. تم العثور على مستويات مرتفعة من hTERT في جامعة كاليفورنيا النشطة بشكل معتدل في الغشاء المخاطي للمرضى الذين يعانون من جامعة كاليفورنيا في المتوسط ​​6 سنوات (29).

For examination of possible differences in the levels of hTERT within the progressors we stratified the areas of the 20 progressor colectomies by morphological characteristics, and compared diploid areas with areas containing aneuploid clones, using LMM. This comparison showed a pattern of lower hTERT expression in aneuploid lesions within areas of similar morphology. Within the non-dysplastic lesions this difference was statistically significant (p=0.037). If each lesion was included in the analysis as independent data entries (Student’s t-test), we found a significant difference between hTERT levels in diploid and aneuploid lesions indefinite for dysplasia. However, the protein levels of hTERT vary between patients, a fact that potentially affects our statistical findings, creating false positives. Several of the aneuploid lesions of indefinite dysplastic morphology were found within the same colon (Table I), and this could skew our results. We therefore found the p-values yielded by the LMM analysis controlling for patient variations to be valid. The hTERT-protein expression in diploid, non-dysplastic lesions did not differ from the levels found in the non-progressors, which are all non-dysplastic and diploid. This shows that when the confounding factor of differences in mucosal morphology is accounted for, reduced levels of hTERT are linked to DNA aneuploidy and possibly also associated with its development. Increased levels of hTERT may enhance the proliferative activity of the inflamed tissue harbouring increased levels of reactive oxygen species (ROS), and possibly contribute to the development of dysplasia and cancer. It has been demonstrated that UC colons have enhanced cell proliferation (24) and elevated levels of ROS (30). Both these agents are reported to facilitate telomere shortening. Too short or even missing telomeres can induce breakage-fusion-bridge (BFB) cycles, which again can lead to chromosomal instability (5) and DNA aneuploidy (31,32). Elevated levels of BFB were shown in UC-progressor colons, but DNA-ploidy status of the lesions examined was not investigated (31). Activation of telomerase can prevent BFB-cycles by adding telomeric sequences to short telomeres or broken chromosome ends (33). Our results showing less hTERT present in lesions that contain aneuploid cell populations are consistent with these results.

UC progressors have been shown to differ in mean telomere length depending on the patients’ age at disease onset, where early onset (<50 years of age when diagnosed) harboured shorter telomeres than those observed in UC progressors with later UC onset (26). All our patients had suffered from active colitis for >10 years at the time of colectomy and all had presented extensive colitis. Only two progressors were diagnosed with UC after the age of 50, and these did not differ in hTERT expression from the patients diagnosed at an earlier age.

It is possible that any differences in hTERT levels of the colonic mucosa between the progressors and non-progressors were levelled out by continuous impairment of the colonic mucosa due to inflammation and regeneration. Telomeres in UC colonic mucosa are reported to shorten more rapidly than in non-UC mucosa (27,31), and activation of telomerase might be a response to this attrition. This could indicate that hTERT expression is not a biomarker for differentiating a progressor colon from a non-progressor colon prior to colectomy.

A study of four colectomies from patients suffering from UC for >20 years revealed a regional correlation between dysplasia and telomerase activity measured by a version of the ELISA. One patient did not present dysplasia or telomerase activity (23). However, the ELISA method used in the study detected assembled telomerase enzyme complexes, and it was suggested that lack of detected telomerase activity in some of the samples could be due to degradation of the RNA component of the holoenzyme prior to sampling (23). IHC of hTERT may omit tissue-based problems such as partial degradation, as it is based on visual examination of stained formalin or alcohol-fixed, paraffin-embedded tissue.

IHC facilitates the investigation of protein expression in specific cell types within a tissue. This feature can prove valuable when examining UC colons, where a high percentage of leucocytes are generally present in the mucosa. Examining hTERT protein expression by IHC allowed us to assess the differences in the extent of hTERT expression in the colonic mucosal cells, without the confounding contributions from mucosal leukocytes. In a report examining coronary plaques, neutrophils were found to have elevated levels of telomerase activity (34). This is confirmed in our study by the presence of hTERT-positive leucocytes in the lamina propria (Fig. 1).

However, immunohistochemical detection of hTERT has proven to be a difficult task, as some antibodies can also bind to other proteins not associated with telomerase activity (35), antibodies that are not commercially available, or those that are commercially available but have not been proven to be specific (i.e., non-specific cytoplasmic rather than specific nuclear staining). As new antibodies binding to hTERT have become available and tested for binding specificity, reports of hTERT-expression have emerged. Elevated levels of hTERT in precancerous lesions have been identified in gastric tissue (36), and colonic adenocarcinomas (37). The hTERT protein levels of colonic mucosa may provide insight into the transition from normal-looking mucosal morphology towards a possible colorectal cancer, as normal colonic mucosa has low hTERT levels, whereas colorectal cancers have high levels of hTERT (38). In our study the nuclear hTERT staining was very distinct. The monoclonal hTERT antibody used was specific, as confirmed by western blotting of several human cancer cell lines that showed a single band at 127 kDa as expected (Fig. 2). We have previously shown, that progressors harboured significantly more ultra-short telomeres compared to non-progressor colons, and that the difference remained statistically significant when we compared the diploid, non-dysplastic progressor lesions to the non-progressors. In terms of mean telomere length, no difference was found between progressors and non-progressors (39). Thus, an association between mean telomere length and hTERT protein levels seems to exist, whereas no association was observed between the amount of ultra-short telomeres and levels of hTERT in longstanding UC.

In a previous study, our group showed that the proliferation marker Ki67 was significantly elevated in UC colons compared to non-UC control samples, thus confirming that proliferation is enhanced in UC colonic mucosa (25). Also, protein expression of Ki67 has been shown to increase with advancing degree of growth fraction due to the developing stage of dysplasia in the colonic mucosa of the UC colon (40). We found that hTERT expression was significantly associated with the expression of Ki67 within the non-progressor lesions. Within the progressors this association was lost, even when diploid, non-dysplastic lesions were examined separately. Together with our findings of a borderline significant p-value for association between hTERT and Ki67 within progressor non-dysplasia, and no significance detected within the increasing levels of distorted morphology (Table III), it seems the association between proliferation and hTERT protein expression is lost during the development of dysplasia. The lack of difference in hTERT protein levels between progressors and non-progressors, together with elevated amounts of ultra-short telomeres identified in the progressor lesions and the hTERT/Ki67association found only within non-progressors leads to the hypothesis that the positive association between hTERT and Ki67 in the non-progressors may be a protective agent against shortening of the cells telomeres.

In conclusion, we have shown that the protein levels of hTERT were significantly elevated in the mucosa of progressors and non-progressor UC colons compared to non-UC control samples. In the progressor colons, aneuploid non-dysplastic lesions had a significantly lower expression of hTERT than the diploid non-dysplastic lesions, and diploid, non-dysplastic lesions did not differ from the non-progressors with regard to expression of hTERT protein in the colonic mucosal cells, thus low levels of hTERT associated with aneuploidy. We also found that within the non-progressors there was an association of hTERT expression and expression of the proliferation marker Ki67. No association of hTERT/Ki67 protein expression was detected in the progressors, even when only diploid non-dysplastic lesions were examined, indicating that the association of the two proteins may act as a protective mechanism against the development of progressor characteristics within a UC colon.

شكر وتقدير

The authors would like to thank Thu Hong Thy Nguyen for helping with western blotting. This study was made possible by the generous funding from South-Eastern Norway Regional Health Authority and by Stiftelsen UNI. These organisations had no role in collecting, analysing or interpreting the data or in writing the report.

مراجع

Macdougall IP: The Cancer risk in ulcerative colitis. لانسيت. 2:655–658. 1964. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI


مقدمة

Telomeres are nucleoprotein structures, which protect the ends of linear chromosomes from being recognized as DNA double-strand breaks [1]. Telomeres shorten with each round of cell division due to the end-replication problem. Normal human somatic cells replicate until their telomeres diminish to a critical threshold, at which point they enter permanent cell cycle arrest and are constrained to a senescent state [2]. Bypass of senescence due to loss of function of the p53 and pRB tumor suppressor pathways results in further telomere shortening which eventually becomes catastrophic, causing end-to-end fusions, genetic instability, and the potential for tumorigenesis.

Telomere shortening may be counteracted by telomerase, a ribonucleoprotein enzyme complex that synthesizes the repetitive telomeric DNA sequence (5'-TTAGGG-3') [3]. The subunits of telomerase include a reverse transcriptase protein, TERT, and an RNA molecule, hTR, which contains a template region. Telomerase activity is detectable during human development from the blastocyst stage to 16–18 weeks gestation in specific tissue types, but is undetectable in most tissues by two months post-natal [4]. In healthy adults, telomerase activity is restricted to germline cells (in the testes and ovaries) [4], peripheral blood mononuclear cells [5,6] and stem cells [7], presumably to support the proliferative requirements of these cell types. In germline cells, there is sufficient telomerase activity to prevent telomere shortening, but in somatic cells the level of telomerase activity is limited, and is only sufficient to slow down the telomere attrition that accompanies normal DNA replication. In contrast, in the great majority of cancers and immortalized cell lines telomere length is maintained in 85% of cancers this is due to upregulated levels of telomerase and in the remainder this is due to a non-telomerase mechanism [8,9].

One of the ways in which telomerase activity levels appear to be regulated is via alternative splicing of the TERT pre-mRNA [10]. The TERT gene contains 16 exons, and the TERT pre-mRNA can be spliced to yield more than 20 variant mRNAs [11–13]. During human development, loss of telomerase activity in somatic cells is associated with a change in the TERT splicing pattern such that the transcriptional output of the TERT gene consists entirely of splice variants that do not encode active TERT protein [14,15]. Control of alternative splicing is incompletely understood, but there is evidence that this may involve RNA:RNA pairing within the TERT pre-mRNA [16], and that it may be regulated by the cellular microenvironment [17]. Some of the splice variants encode proteins which can act as dominant negative inhibitors of telomerase activity [18,19]. This may be due in part to their ability to become incorporated into the telomerase enzyme complex, because biochemical studies have demonstrated that telomerase exists as a dimer and that its activity is dependent on both of the hTERT active sites being functional [20].

Mutations in hTERT, and in other genes that are required for normal telomere function, can cause short telomere syndromes, which are characterized by proliferative failure in various tissues, especially the bone marrow, lungs, and liver [21,22]. Patients suffering from these syndromes have a substantially increased risk of cancer [22,23], presumably due to excessive telomere shortening and an increased risk of genetic instability. In contrast to the high risk associated with these relatively rare mutations, genome-wide association studies (GWAS) have uncovered numerous single nucleotide polymorphisms (SNPs) in, or close to the hTERT gene which are relatively common in the population and are associated with a small, but highly significant increase in cancer susceptibility ([13,24–27] reviewed in [28]). Associations have also been found between HTERT SNPs and telomere length [13,24,29].

Despite the statistical robustness of GWAS, the associations remain observational. This is partly because most GWAS have only reported associations with the tagging SNPs in the TERT-CLPTM1L region on the commercial genotyping chips, but fine mapping is required to identify the putative causal SNPs. Mechanistic analysis is required to identify causal rather than correlated variants, and to accurately determine cancer risk. A functional understanding of causative variants may ultimately influence clinical decision-making.

Through our involvement with the Collaborative Oncologic Gene-Environment Study (COGS), we were able to carry out fine mapping of the HTERT المكان. This study revealed that the minor alleles at rs10069690 and at rs2242652 were candidate causal variants for risk of estrogen receptor-negative breast cancer, breast cancer in BRCA1 mutation carriers, serous low malignant potential ovarian cancer and serous invasive ovarian cancer with odds ratios ranging from 1.15–1.40 [13,24] and for risk of prostate cancer [13,24]. This rs10069690 SNP is also associated with risk of a wide variety of cancers, including colon cancer, acute lymphoblastic leukemia (ALL), and chronic lymphocytic leukemia (CLL) [25,30–32]. However, no fine mapping has been performed for the latter associations to determine whether it is likely to be directly responsible or simply correlated with a better candidate causal SNP. Consequently, there is a growing need to delineate how this allele confers cancer risk.

We previously generated hTERT minigenes, which included intron 4 with the major (G) or minor, cancer-risk associated (A) allele at rs10069690 [13]. Transfection of these minigenes into the telomerase-positive breast cancer cell line MCF7, and RT-PCR using primers spanning intron 4, revealed an additional band in the presence of the A allele [13]. When this band was excised and sequenced it was identified as a novel hTERT splice variant, INS1b, which contains an intron 4 insert of 480 base pairs. Sequence analysis showed that this transcript was the product of an alternative splicing event at an additional splice donor site created by the G to A polymorphism at rs10069690 (Fig 1A).

(A) Schematics of hTERT minigenes generated by inserting the intron 4 sequence, containing either the major (G) or minor (A) allele at rs10069690, into an hTERT cDNA expression construct. The sense-strand sequence of the minigene from the end of exon 4 to the beginning of exon 5 is shown. The red text indicates the splice site consensus sequences with vertical lines representing the exon-intron boundaries. The minor allele at rs10069690, a G to A polymorphism, introduces an additional splice donor site into the sequence. If this site is utilized, 480 bp of intron 4 is retained within the mature mRNA. (B) Schematic of mRNA and protein expression resulting from the minor allele at rs10069690. RT-PCR using primers spanning from the end of exon 3/beginning of exon 4 to the middle of exon 6 generate a 441 bp product from canonically spliced hTERT mRNA, and products that are 38 bp and 480 bp larger from alternative hTERT splice products INS1 and INS1b, respectively. The alternative splice variant formed from the utilization of the additional splice donor site contains a premature stop codon and is therefore predicted to encode a truncated form of hTERT, which contains the telomerase N-terminal (TEN) and RNA binding (RBD) domains, but not the reverse transcriptase (RT) and C-terminal (C-term) domains. (C) Three cell lines (HT1080, MCF7 and A2780) and cell strain (Fre-71s-1) were transfected with hTERT minigenes containing intron 4 with either the Major (G) or Minor (A) allele of rs10069690. RT-PCR was performed with the primers indicated in Fig 1B and products were separated by gel electrophoresis. In each case, the minigene with the minor allele at rs10069690 resulted in co-expression of canonical hTERT, and the variants INS1 and INS1b. Other bands were identified as non-specific (ns) hybrid DNA species, including a mixture of INS1b and canonical hTERT (INS1b/hTERT) transcripts. (D) RT-PCR was performed on cell lines homozygous (AA) or heterozygous (AG) for the minor allele at rs10069690 to identify endogenous expression of INS1b.

In the present study, we investigated the mechanism by which the SNP confers elevated cancer risk. We found that the presence of this polymorphism resulted in the production of both full length and an alternatively spliced hTERT transcript, which were expressed in a cell type-specific manner. The alternative transcript produced a severely truncated protein (INS1b), which retained its hTR binding capability but lacked the reverse transcriptase domain. INS1b directly caused decreased telomerase activity, telomere shortening, and an elevated telomere-specific DNA damage response. Our data demonstrate that INS1b binds to hTR, sequestering it in an inactive form, thereby acting in a dominant negative manner to limit the amount of active telomerase available to extend the telomeres. The combination of the fine mapping data and a mechanism for cancer risk make it highly likely that this is a causal, rather than a correlated cancer risk SNP.


المقدمة

Lung cancer retains the leading position in cancer-related deaths in the United States. In 2002, it is estimated that there will be 154,900 deaths and 169,400 new cases from lung and bronchial cancer in the United States, compared with 156,900 deaths and 164,100 new cases in 2000 (1) . NSCLC3 comprises more than 80% of lung cancers, and complete surgical resection of primary tumors in early-stage disease is the only potentially curative treatment. For patients with stage I NSCLC (about 17% of all patients with NSCLC), the average 5-year survival rate is about 60%. Adjuvant cytotoxic chemotherapy has been proposed and evaluated in the setting of NSCLC, and it offers limited hope of improving prognosis (2) . One area of intense research on early-stage NSCLC is the identification of molecular markers to complement TNM staging to fully assess the prognosis of patients and to evaluate the effects of novel chemotherapy agents and regimens (3) . Such prognostic markers include a wide variety of protein molecular markers that can be classified by different antibodies as molecular genetic markers, metastatic propensity markers, differentiation markers, and proliferation markers (3) . Other markers have been evaluated at the mRNA level including retinoic acid receptor-β, cyclooxygenase-2, vascular endothelial growth factor, MMP-2 and -9, E-cadherin, angiopoietin-2, and CD44. These markers have been associated with clinicopathological variables and survival time in patients with NSCLC (4, 5, 6, 7, 8) .

Telomerase is a ribonucleoprotein enzyme that lengthens chromosome ends that have been shortened during successive cycles of cell division (9) . Telomerase is expressed in up to 85% of NSCLCs (10 , 11) , and its activation plays a critical role in tumorigenesis by sustaining cellular immortality (12 , 13) . Hahn وآخرون. (14) proved that disruption of the intracellular pathways regulated by large T antigen, oncogenic ras, and telomerase suffices to create a human tumor cell. The components of human telomerase include an RNA subunit (hTERC), a catalytic protein subunit (hTERT), and other telomerase-associated proteins (15) . It has been shown that the expression pattern of hTERT is closely associated with telomerase activity (16, 17, 18) . The recent development of ISH techniques that can reliably detect hTERT mRNA has made it possible to examine the expression of this critical telomerase component at the single-cell level (18, 19, 20, 21) . In our previous study (22) , we evaluated hTERT expression in bronchial biopsy samples and found that it was a frequent event and appeared at a very early stage in cigarette smoking-induced lung carcinogenesis, making it clearer that telomerase plays a critical role in tumorigenesis. Because we have established a reliable ISH technique for detecting hTERT mRNA expression in paraffin-embedded tissue, we decided to evaluate the prognostic value of hTERT in a relatively homogeneous tumor, in a population of 153 patients with stage I NSCLC.


مراجع

Blackburn EH: Telomeres and telomerase: their mechanisms of action and the effects of altering their functions. FEBS ليت. 2005, 579: 859-862. 10.1016/j.febslet.2004.11.036.

Shay JW, Bacchetti S: A survey of telomerase activity in human cancer. Eur J Cancer. 1997, 33: 787-791. 10.1016/S0959-8049(97)00062-2.

Belgiovine C, Chiodi I, Mondello C: Telomerase: cellular immortalization and neoplastic transformation. Multiple functions of a multifaceted complex. Cytogenet Genome Res. 2008, 122: 255-262. 10.1159/000167811.

Nakayama J, Tahara H, Tahara E, Saito M, Ito K, Nakamura H, Nakanishi T, Tahara E, Ide T, Ishikawa F: Telomerase activation by hTRT in human normal fibroblasts and hepatocellular carcinomas. نات جينيه. 1998, 18: 65-68. 10.1038/ng0198-65.

Meyerson M, Counter CM, Eaton EN, Ellisen LW, Steiner P, Caddle SD, Ziaugra L, Beijersbergen RL, Davidoff MJ, Liu Q, Bacchetti S, Haber DA, Weinberg RA: hEST2, the putative human telomerase catalytic subunit gene, is up-regulated in tumor cells and during immortalization. زنزانة. 1997, 90: 785-795. 10.1016/S0092-8674(00)80538-3.

Horikawa I, Barrett JC: Transcriptional regulation of the telomerase hTERT gene as a target for cellular and viral oncogenic mechanisms. Carcinogenesis. 2003, 24: 1167-1176. 10.1093/carcin/bgg085.

Flores I, Benetti R, Blasco MA: Telomerase regulation and stem cell behaviour. Curr Opin Cell Biol. 2006, 18: 254-260. 10.1016/j.ceb.2006.03.003.

Ohmura H, Tahara H, Suzuki M, Ide T, Shimizu M, Yoshida MA, Tahara E, Shay JW, Barrett JC, Oshimura M: Restoration of the cellular senescence program and repression of telomerase by human chromosome 3. Jpn J Cancer Res. 1995, 86: 899-904.

Tanaka H, Shimizu M, Horikawa I, Kugoh H, Yokota J, Barrett JC, Oshimura M: Evidence for a putative telomerase repressor gene in the 3p14.2-p21.1 region. Genes Chromosomes Cancer. 1998, 23: 123-133. 10.1002/(SICI)1098-2264(199810)23:2<123::AID-GCC5>3.0.CO2-4.

Horikawa I, Oshimura M, Barrett JC: Repression of the telomerase catalytic subunit by a gene on human chromosome 3 that induces cellular senescence. Mol Carcinog. 1998, 22: 65-72. 10.1002/(SICI)1098-2744(199806)22:2<65::AID-MC1>3.0.CO2-J.

National Center for Biotechnology Information. [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/]

Horikawa I, Cable PL, Mazur SJ, Appella E, Afshari CA, Barrett JC: Downstream E-box-mediated regulation of the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene transcription: evidence for an endogenous mechanism of transcriptional repression. Mol Biol Cell. 2002, 13: 2585-2597. 10.1091/mbc.E01-11-0107.

Ducrest AL, Amacker M, Mathieu YD, Cuthbert AP, Trott DA, Newbold RF, Nabholz M, Lingner J: Regulation of human telomerase activity: repression by normal chromosome 3 abolishes nuclear telomerase reverse transcriptase transcripts but does not affect c-Myc activity. الدقة السرطان. 2001, 61: 7594-7602.

Szutorisz H, Lingner J, Cuthbert AP, Trott DA, Newbold RF, Nabholz M: A chromosome 3-encoded repressor of the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene controls the state of hTERT chromatin. الدقة السرطان. 2003, 63: 689-695.

Dowdy SF, Scanlon DJ, Fasching CL, Casey G, Stanbridge EJ: Irradiation microcell-mediated chromosome transfer (XMMCT): The generation of specific Chromosomal arm deletions. Genes Chromosomes Cancer. 1990, 2: 318-327. 10.1002/gcc.2870020410.

Imreh S, Klein G, Zabarovsky ER: Search for unknown tumor-antagonizing genes. Genes Chromosomes Cancer. 2003, 38: 307-321. 10.1002/gcc.10271.

Buerstedde JM, Takeda S: Increased ratio of targeted to random integration after transfection of chicken B cell lines. زنزانة. 1991, 67: 179-188. 10.1016/0092-8674(91)90581-I.

Dieken ES, Epner EM, Fiering S, Fournier RE, Groudine M: Efficient modification of human chromosomal alleles using recombination-proficient chicken/human microcell hybrids. نات جينيه. 1996, 12: 174-182. 10.1038/ng0296-174.

Koi M, Lamb PW, Filatov L, Feinberg AP, Barrett JC: Construction of chicken x human microcell hybrids for human gene targeting. Cytogenet Cell Genet. 1997, 76: 72-76. 10.1159/000134519.

Kuroiwa Y, Shinohara T, Notsu T, Tomizuka K, Yoshida H, Takeda S, Oshimura M, Ishida I: Efficient modification of a human chromosome by telomere-directed truncation in high homologous recombination-proficient chicken DT40 cells. الدقة الأحماض النووية. 1998, 26: 3447-3448. 10.1093/nar/26.14.3447.

Meaburn KJ, Parris CN, Bridger JM: The manipulation of chromosomes by mankind: the uses of microcell-mediated chromosome transfer. Chromosoma. 2005, 114: 263-274. 10.1007/s00412-005-0014-8.

Nishimoto A, Miura N, Horikawa I, Kugoh H, Murakami Y, Hirohashi S, Kawasaki H, Gazdar A, Shay J, Barrett JC, Oshimura M: Functional evidence for a telomerase repressor gene on human chromosome 10p15.1. الأورام. 2001, 20: 828-835. 10.1038/sj.onc.1204165.

Oshimura M, Barrett JC: Multiple pathways to cellular senescence: role of telomerase repressors. Eur J Cancer. 1997, 33: 710-715. 10.1016/S0959-8049(97)00090-7.

Tanaka H, Horikawa I, Barrett JC, Oshimura M: Evidence for inactivation of distinct telomerase repressor genes in different types of human cancers. Int J Cancer. 2005, 115: 653-657. 10.1002/ijc.20879.

Ji L, Minna JD, Roth JA: 3p21.3 tumor suppressor cluster: prospects for translational applications. Oncol المستقبل. 2005, 1: 79-92. 10.1517/14796694.1.1.79.

Szutorisz H, Lingner J, Cuthbert AP, Trott DA, Newbold RF, Nabholz M: A chromosome 3-encoded repressor of the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene controls the state of hTERT chromatin. الدقة السرطان. 2003, 63: 689-695.

Yang ZQ, Yoshida MA, Fukuda Y, Kurihara N, Nakamura Y, Inazawa J: Molecular cytogenetic analysis of 17 renal cancer cell lines: increased copy number at 5q31-33 in cell lines from nonpapillary carcinomas. Jpn J Cancer Res. 2000, 91: 156-163.

Garzon R, Calin GA, Croce CM: MicroRNAs in Cancer. Annu Rev Med. 2009, 60: 167-179. 10.1146/annurev.med.59.053006.104707.

Mitomo S, Maesawa C, Ogasawara S, Iwaya T, Shibazaki M, Yashima-Abo A, Kotani K, Oikawa H, Sakurai E, Izutsu N, Kato K, Komatsu H, Ikeda K, Wakabayashi G, Masuda T: Downregulation of miR-138 is associated with overexpression of human telomerase reverse transcriptase protein in human anaplastic thyroid carcinoma cell lines. علوم السرطان. 2008, 99: 280-286. 10.1111/j.1349-7006.2007.00666.x.

Hoshiya H, Kazuki Y, Abe S, Takiguchi M, Kajitani N, Watanabe Y, Yoshino T, Shirayoshi Y, Higaki K, Messina G, Cossu G, Oshimura M: A highly stable and nonintegrated human artificial chromosome (HAC) containing the 2.4 Mb entire human dystrophin gene. مول هناك. 2009, 17: 309-317. 10.1038/mt.2008.253.

Katoh M, Ayabe F, Norikane S, Okada T, Masumoto H, Horike S, Shirayoshi Y, Oshimura M: Construction of a novel human artificial chromosome vector for gene delivery. Biochem Biophys Res Commun. 2004, 321: 280-290. 10.1016/j.bbrc.2004.06.145.

Kazuki Y, Hoshiya H, Kai Y, Abe S, Takiguchi M, Osaki M, Kawazoe S, Katoh M, Kanatsu-Shinohara M, Inoue K, Kajitani N, Yoshino T, Shirayoshi Y, Ogura A, Shinohara T, Barrett JC, Oshimura M: Correction of a genetic defect in multipotent germline stem cells using a human artificial chromosome. الجين هناك. 2008, 15: 617-624. 10.1038/sj.gt.3303091.

Kouprina N, Larionov V: TAR cloning: insights into gene function, long-range haplotypes and genome structure and evolution. نات ريف جينيت. 2006, 7: 805-812. 10.1038/nrg1943.

Nihei N, Kouprina N, Larionov V, Oshima J, Martin GM, Ichikawa T, Barrett JC: Functional evidence for a metastasis suppressor gene for rat prostate cancer within a 60-kilobase region on human chromosome 8p21-p12. الدقة السرطان. 2002, 62: 367-370.

Kugoh HM, Hashiba H, Shimizu M, Oshimura M: Suggestive evidence for functionally distinct, tumor-suppressor genes on chromosomes 1 and 11 for a human fibrosarcoma cell line, HT1080. الأورام. 1990, 5: 1637-1644.

Wong JM, Kusdra L, Collins K: Subnuclear shuttling of human telomerase induced by transformation and DNA damage. Nat Cell Biol. 2002, 4: 731-736. 10.1038/ncb846.

Tomizuka K, Yoshida H, Uejima H, Kugoh H, Sato K, Ohguma A, Hayasaka M, Hanaoka K, Oshimura M, Ishida I: Functional expression and germline transmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice. نات جينيه. 1997, 16: 133-143. 10.1038/ng0697-133.


شكر وتقدير

Grant support: National Health and Medical Research Council (NHMRC) Peter Doherty Postdoctoral Fellowships (228413, Y. Cao 228412, A.S. Nouwens), NHMRC Healthy Ageing Research Grant (219306, L.I. Huschtscha and R.R. Reddel), and a Wellcome Trust Senior Research Fellowship (GRO66727MA, T.M. Bryan).

The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. This article must therefore be hereby marked advertisement in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.

We thank Kathleen Collins for the construct pBABE-puro-U3-hTR Karen MacKenzie and Laura Veas for the hTR2 and B2M primers Julie Jurczyluk for the construct pJJ101-hTERT1-182aa, في المختبر transcribed hTR, and technical assistance Scott Cohen for the construct pUC-hTR and the direct telomerase activity assay and Jeremy Henson, Akira Nguyen, Ze Huai Zhong, Jane Noble, and Elizabeth Collins for technical assistance and advice.


شاهد الفيديو: محاضرة عن القصر البديل ودورة فى التنوع الحيوى (أغسطس 2022).